阪崎肠杆菌活菌检测试剂盒

      阪崎肠杆菌（Enterobactersakazaii）是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。本公司自主研制的阪崎肠杆菌活菌荧光PCR检测试剂盒能快速检测出奶粉（乳）制品中存在的阪崎肠杆菌菌属，且相比DNA-PCR的检测方法，本检测方法可以区分死菌和活菌，因此不需要进行再次验证。

本试剂盒通过实时荧光RT-PCR反应对奶粉（乳）制品中的阪崎肠杆菌进行定性检测，灵敏度高，特异性强，

能快速检测出奶粉（乳）制品中的阪崎肠杆菌。

储存条件

本试剂盒保存于-20℃，有效期12        个月。 

检测步骤

1.样本处理

 取100g(ml)样品，加入900ml的无菌蒸馏水，震荡溶解，与37度培养15h左右。移取1ml转入 10ml改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤中，37度震荡培养约6h 。  

2.样本RNA提取 取1.5ml增菌液，采用商品化的细菌RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明提取样本        RNA。采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA 待用。  

3.试剂准备

冰上解冻反应试剂，反应液保持避光，解冻后将反应液混匀并简短离心，按每管15ul的量分装至PCR管中。        

4.PCR加样

每管中加入cDNA样本10ul，盖好管盖，简短离心，同时做阳性对照，阴性对照和空白对照（以水代替样本        cDNA）。

5.PCR扩增

将加好的样品放置在PCR仪中，荧光通道选择FAM， PCR反应参数见表，使用不同的PCR仪，反应参数可适当调整。 

6.结果分析

基线和阈值的设置：基线范围设置在3-15个循环，阈值设置在基线刚好超过阴性对照扩增曲线的**高点。

质量控制：阳性对照CT≤30，有S        型扩增曲线；阴性对照无CT值，扩增曲线为直线；空白对照无CT值，扩增曲线为直线。若出现任一结果不正常，需重做实验。 

结果判定

1.检测样品无CT值，曲线为直线或无S 型扩增曲线，判定结果为阴性。  

2.检测样品CT≤35，出现S型扩增曲线，判定结果为阳性。

3.检测样品35﹤CT﹤40并有S型扩增曲线，需适当增加DNA模板量后重新做实时荧光PCR检测，再次检测结果CT值仍处于35和40之间，并且有S 型扩增曲线，判定结果为阳性，否则判定为阴性。

**低检测限 8cfu/100g(ml) 

注意事项

   1.初次使用前请仔细阅读说明书，并严格按照说明书进行操作。

   2.实验操作要严格分区，防止污染。

   3.RNA提取时要使用无RNA酶的枪头和管子，防止RNA降解。

   4.反应液反复冻融会降低灵敏度，建议分管保存。

   5.本试剂盒仅供定性筛查用。