军团菌的滤膜法检测方法

   军团菌是一种环境感染性致病菌，可引起急性呼吸道传染病，即军团菌病。军团菌分布极其广泛，医院、酒店等的供水系统、空调的冷却系统等各种水源均易于滋生、污染军团菌，并造成军团菌病传染的风险。即与水有关的地方均可能存在军团菌。
　　军团菌传播、感染有以下特点：
1、透过空气、水份感染，传播带季节性，超过50%病例在夏季发生。
2、滋生在医院、酒店的供水系统，通过过水龙头、浴室传播。
3、可通过空调的冷却系统，由通风口传播并感染对象。
　　军团菌属革兰氏阴性杆菌，专性需氧，无芽孢，无荚膜，军团菌需要半胱氨酸和铁，无半胱氨酸时，军团菌无法生长。生化特征还有不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐，氧化酶实验阴性或弱阳性，尿素酶阴性，军团菌生长的最适pH为6.9-7.0，2%-5%CO2能促进部分菌株的生长。军团菌生长缓慢，易于被其它菌落覆盖。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色。菌落整齐，表面光滑，在紫外灯下，有荧光。目前军团菌分为64种血清型及42个种。
 二、军团菌的检测方法---ISO11731:1998 
1.范围
 本标准描述了一种用于军团菌分离和估计环境样品中军团菌数量的培养方法。该方法适用于所有环境样本，包括饮用水、工业用水和天然水以及沉淀物、沉积物和粘土/软泥等相关样本。
2.培养基和试剂
2.1：CP0020 BCYE平板（军团菌生长平板）                 
2.2：P0030 BCYE-CYS平板（BCYE无L-半胱氨酸平板）      
2.3：CP0040 GVPC选择性平板（军团菌选择性平板）       
2.4：酸处理缓冲液
3．取样
3.1取样容器
水样可采用玻璃、聚乙烯或类似容器。以前用过的容器应该清洗干净、扣干水分，121℃高压灭菌15min。如果容器不能经受高压灭菌，应在高于70℃的流动热水或流动蒸汽中处理至少5min。
3.2含生物防腐剂的样品
如果水样中含有或被认为含有氧化型生物防腐剂，应在取样时或取样前加入非活性试剂加以中和。如果水样中含有消毒剂，需在采样前或采样后加入中和剂，含氯或氧化型消毒剂可用硫代硫酸钠或硫代硫酸钾作中和剂。原则上讲，实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析，最好是取样当天，尤其对于已知含生物防腐剂的样品。因此，建议从样品采集到制备好浓缩样的间隔最好为2d，不应超过5d，最长不超过14d。
 3.3样品运输
样品应在6-18℃条件下被运输，应避免热和光照，最好在1d内，不超过2d将样品送到指定实验室。
4．制样
4.1 总则
如果液体样品军团菌的数量估计超过105CFU/L，可以采用直接平板法，即直接涂布于GVPC平板。为了确保低于这个数量样品中军团菌的检测，需采用浓缩技术。为了浓缩水样，可采用膜过滤法（4.2）或离心法（4.3）。
4.2膜过滤法
如果样品是浑浊的、乳浊的或有颜色的，应采用离心法。采用MFS型膜过滤装置进行膜过滤，采用直径47mm，孔径0.22μm和0.45μm的无菌白底黑格膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，加5ml-25ml的无菌稀释液或无菌去离子水，不断摇动至少2min。也可将容器放入超声波中2-10min。
4.3.离心法
取200ml样品于300-500ml容积的离心瓶中，6000g离心10min或3000g离心30min，保持温度在15-25℃，弃去上清液，将沉淀物悬浮在2-20ml无菌稀释液或无菌去离子水中。
培养
5.1.将制备好的样品（浓缩的或未浓缩的）分成3份，1份不做任何处理；1份进行热处理；1份进行酸处理。
5.2热处理：加1±0.5ml样品于一无菌容器中，50±1℃水浴处理30±2min。
5.3.酸处理:加1-10ml样品于一拧盖的容器中，6000g离心10min或3000g离心30min，用无菌枪头吸去一半体积的上清液，通过涡旋重新悬浮剩余物用酸处理缓冲液补足原始体积。混合静置5±0.5min。
5.4.革兰氏染色:团菌生长较慢，次日生长的菌落可直接弃去。军团菌菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色。菌落整齐，表面光滑，在紫外灯下有荧光。军团菌为革兰氏阴性杆菌。
5.4.菌落验证:从每个平皿上选几个可疑菌落，接种BCYE、BCYE-Cys平板和血平板进行传代培养，凡在BCYE平板上生长，而在BCYE-Cys平板上不生长的菌极可能是军团菌。
5.5.军团菌计数：从三个GVPC平板中选择确证菌数最多的平板进行计数，再除以浓缩倍数，作为军团菌数的估计值。