德国拜发D异柠檬酸试剂盒
德国拜发D-异柠檬酸试剂盒
酶法分析试剂盒，用于检测食品饮料中的D－异柠檬酸含量，每个试剂盒约33次测试，是目前检测果汁饮料中果汁含量的国标方法。
D-异柠檬酸试剂盒（酶学试剂盒）
酶法分析试剂盒（紫外分光光度法）
RIDASCREEN（产品编号：0 414 433） 30次检测
1. 简介
此法适用于食品（果汁、含果汁饮料、水果类产品）和一些物质中D-异柠檬酸，D-异柠檬酸内酯及D-异柠檬酸酯类的检测。
2. 原理
D-异柠檬酸在辅酶Ⅱ及D-异柠檬酸脱氢酶作用下可氧化脱羧生成2-酮戊二酸，二氧化碳及还原型辅酶Ⅱ样； 反应式为
D-异柠檬酸脱氢酶
D-Isocitrate +NADP﹢ 2-oxoglutarate +Co2 +NADPH + H+
其中NADPH的量取决于D-异柠檬酸的量，NADPH可在334nm，340nm，365nm下进行测定。
环状的D-异柠檬酸酯类及内酯类经氢氧化钠水解后可按上述原理进行测定； 反应式为
PH9-10
D-异柠檬酸酯类 + 水 D-异柠檬酸+乙醇
PH9-10
D-异柠檬酸内酯类 + 水 D-异柠檬酸
3. 试剂盒内容物
----瓶1约30ml溶液，包括：咪唑缓冲液，PH约7.1
----瓶2约60mg冷冻干燥物，包括：NADP 约45mg；硫酸锰
----瓶3为D-异柠檬酸脱氢酶冷冻干燥物约5U
4. 检测溶液的制备
----用瓶1中所有溶液溶解瓶2中内容物，形成溶液2
----用1.8ml重蒸水溶解瓶3内容物形成溶液3
5. 操作者应该注意之事项
----D-异柠檬酸检测中使用的试剂对人无毒害，但仍要遵守所有化学试剂都要遵守的一般全规则
----使用过的试剂放入实验室垃圾桶，如有需要在保留
6. 储存条件
----瓶1需在2-8℃下保存（见标签），溶液1使用前需回至室温20-25℃
----瓶2需保存在2-8℃(见标签)，溶液2在2-8℃下可保存4周，-15℃到-25℃下可保存约两个月
----瓶3需在2-8℃下保存（见标签），溶液3在2-8℃下可保存4周，-15℃到-25℃下可保存约两个月
7. 样品处理
----直接取用无色，透明，中性的溶液或按稀释表格进行稀释后进行检测，体积为2.000ml
----过滤混浊溶液
----除去样品溶液中的二氧化碳气体
----加入氢氧化钠或氢氧化钾来调节酸溶液的PH值约为8
----加入氢氧化钠或氢氧化钾来调节酸溶液或淡颜色的溶液的PH值至7-7.5，并孵育约30分钟
----用高氯酸或三氯乙酸除去样品中包被的蛋白质，而后用Carrez试剂澄清
----用热水抽提样品中的脂肪（抽提温度需高于该脂肪的熔点），冷却后分去脂肪，而后移至容量瓶中并加水至刻度线在冰浴中放置15分钟，过滤；热水抽提后用Carrez试剂澄清
----用三氯乙酸或Carrez试剂除去乳剂
8. 过程
1. 波长：340nm,Hg365nm或Hg334nm
2. 比色杯：光径1.0cm
3. 温度：20-25℃
4. **终体积：3.050ml
5. 对照空气（光路上无比色杯）或对照水读取读数
6. 样品溶液：2-100ugD-异柠檬酸\检测（0.100-2.000ml样品溶液）
7. 具体操作见如下表格
移液 空白（ml） 样品（ml）
溶液2
样品溶液
重蒸水 1.000
-
2.000 1.000
0.100
1.900
混和，约在3分钟后读取吸光度值A1，而后加入下列物质。
溶液3 0.050 0.050
混和，反应进行10分钟后读取吸光度值A2。
如果反应在10分钟后没有停止，继续以2分钟的间隔读取读数，直至吸光度值在2分钟后不断增加。
分别测样品与空白的吸光度值差，而后用样品吸光度值差减去空白吸光度值差可以得到如下公式
△A=(A2―A1)Sample―(A2―A1)blank
9. 计算
根据以下公式计算浓度
V×MW
C= --------------------×△A(g/l)
ε×d×v×1000
V=**终体积（ml）
V=样品体积（ml）
MW=被检测物质的摩尔质量
D=光径（cm）
ε=NADH的消光系数
340nm=6.3(1×mmol-1×cm-1)
Hg365nm=3.4(1×mmol-1×cm-1)
Hg334nm=6.18(1×mmol-1×cm-1)
D-异柠檬酸含量计算遵守如下公式
3.050×192.1
C= -----------------------------×△A
ε×1.00×0.100×1000
5.859
= --------------×△A（g D-异柠檬酸/l样品溶液）
ε
如果样品溶液是稀释使用的，在计算结果时需乘以稀释系数F。
当分析固体或半固体时，测量前需称一定重量配制样品溶液，其结果需按下式计算
C D-异柠檬酸（g/l样品溶液）
CD-异柠檬酸 =-----------------------------×100（g/100g）
W D-异柠檬酸（在样品溶液中）
10. 检测操作说明
被检测样品中D-异柠檬酸的量若在3ug和100ug之间，可在365nm下测量，若在2ug和50ug之间，可在340nm，334nm下测量。为了得到一个足够的吸光度值，样品溶液需稀释，其中D-异柠檬酸的浓度**好在0.2和1.0g/L或0.1和0.5g/L。
稀释表格
每升溶液乳糖，D-半乳糖估计量
340或334nm 365nm 用水
稀释 稀释
倍数
<0.5g
0.5-5.0g
>5.0g <1g
1.0-10.0g
>10.0g -
1+9
1+99 1
10
100
如果吸光度值较低，例如低于0.100，样品溶液需重新配制，可由下列几种解决方法
1. 可多称出些样品或不要过分稀释。
2. 加入到比色杯中的溶液体积可增加至2.000ml，若可能需中和样品溶液。当然为了得到相同的**终体积（样品和空白），加入的水的体积就要相应减少。所加入的新溶液的体积在计算时是要考虑进去的。
11. 技术信息
1. 果汁分析中Wallrauch沉淀技术应用较为广泛。
2. 当检测强酸样品时（如葡萄汁），氨溶液的体积需要增加：需加至2.5ml否则结果会偏低，在检测前**好中和强酸样品。
3. 在做重复实验时D，L-异柠檬酸三钠二水化合物将会被考虑进来，其分子量也会被应用，另外在酶促反应中只有D-型反应才会被考虑。
12. 特性
1. 异柠檬酸脱氢酶特异性地催化氧化D-异柠檬酸脱去二氧化碳。
2. 制备好的D-异柠檬酸脱氢酶中可能会含有L-苹果酸脱氢酶和乌头酸酶，尽管如此，L-苹果酸过量100倍及柠檬酸过量200倍也不会影响D-异柠檬酸的检测，若样品中含有大量的L-苹果酸和柠檬酸，那么样品基质的蠕变反应可通过判断来消除。
3. 在检测工业D，L-异柠檬酸三钠的二水化合物时其中大约有50%可被检测出来（因其中只有D-型可进行酶促反应）
13. 灵敏度
**小吸光度值差为0.5个吸光单位，相应的**大溶液体积为V=2.000ml，340nm下D-异柠檬酸浓度为0.25mg/l；若样品体积V=0.100ml，相应的D-异柠檬酸浓度为5mg/L。